Balcão, Victor ManuelVila, Marta Maria Duarte CarvalhoGlasser, Cássia AntunesGlasser, Cássia Antunes2023-05-092023-05-092016https://repositorio.uniso.br/handle/uniso/731Introdução: A estabilização de entidades bioativas assume particular relevância em função das diversas aplicações em distintas áreas como a farmacêutica, a alimentar, a de cosméticos, a (bio)médica e a biotecnológica. Especificamente, a estabilização de entidades proteicas com vista à preservação tanto da estrutura como da funcionalidade durante o armazenamento, sendo essa estabilização conseguida principalmente através do estabelecimento de um equilíbrio termodinâmico entre as (bio)entidades e o seu (micro)ambiente. Um sistema nanoestruturado do tipo emulsão A/O/A preparado com vista a estabilização de entidades proteica é por natureza um sistema termodinamicamente instável. A otimização, por via de um planejamento fatorial estatístico, das várias variáveis processuais que permita a produção de tal sistema com características estáveis ao longo de um período alargado de armazenamento é, por isso, de suma importância. Existe um delicado equilíbrio entre a estabilidade e a flexibilidade necessárias à função das biomoléculas, a que se soma o aumento do conhecimento da importância da superfície das moléculas proteicas para a sua estabilidade, uma vez que é através desta interface que a entidade proteica interage com o "mundo externo". É geralmente aceito que a importância funcional dos resíduos de aminoácidos está relacionada com a sua acessibilidade a solventes na superfície da proteína, enquanto que a importância estrutural desses resíduos de aminoácidos está relacionada com a sua localização como parte do núcleo (hidrofóbico) da proteína. Objetivos: O objetivo principal deste trabalho de pesquisa aplicada consistiu no desenvolvimento de um sistema nanoestruturado do tipo emulsão água-em-óleo-em-água (A/O/A) e na sua otimização estatística para encapsulação de uma entidade proteica, uma vez que, devido à sua estrutura interna compartimentalizada, as nanoemulsões do tipo A/O/A apresentam claras vantagens para a estabilização estrutural e funcional dessas biomoléculas. Métodos: Foi desenhado um planejamento fatorial experimental completo do tipo 23x31 (3 fatores em 2 níveis, inferior e superior, e 1 fator em três níveis), para avaliar a influência de quatro fatores nas propriedades físicoquímicas de emulsões do tipo A/O/A. Os fatores (variáveis independentes) sob escrutínio foram (i) concentração de proteína modelo (colágeno) em dois níveis, baixo (-1) e alto (+1); concentração de surfactante lipofílico (lecitina de soja) em dois níveis, baixo (-1) e alto (+1); concentração de surfactante hidrofílico (poloxâmero 188) em dois níveis, baixo (-1) e alto (+1); e velocidade de homogeneização em três níveis, baixo (7500 rpm), médio (10000 rpm) e alto (12500 rpm). As variáveis dependentes avaliadas foram o tamanho hidrodinâmico (HS) médio de partícula, o índice de polidispersão (PI) e o Potencial Zeta (ZP). A combinação dos quatro fatores resultou num total de 24 “tratamentos” (24 misturas). Adicionalmente, os pontos centrais dos três primeiros fatores foram também inseridos, os quais, combinados com os três níveis de velocidade de homogeneização, resultaram em três tratamentos adicionais que foram replicados três vezes cada. O planejamento fatorial desenhado originou assim a produção de um total de 33 emulsões do tipo A/O/A, por combinação dos quatro fatores, as quais foram caracterizadas fisico-quimicamente através da determinação, ao longo do tempo de armazenamento, do tamanho hidrodinâmico de partícula (HS), distribuição de tamanhos de partícula (PI) e carga superficial das partículas através da determinação do Potencial Zeta (ZP). As variáveis HS, PI e ZP foram medidas em triplicata, para cada mistura, e os valores médios foram considerados para as análises estatísticas dos resultados. Para a formulação ótima, foram ainda realizadas análises por FTIR, DRX, crio-MET, TGA e DSC. Foi ainda determinada a eficiência de encapsulação da emulsão otimizada estatisticamente, bem como analisada estatisticamente a sua estabilidade ao longo de um período de armazenamento de um ano. Resultados e Discussão: As concentrações de proteína e dos emulsificantes lipofílico e hidrofílico, e a velocidade de homogeneização, foram estabelecidas como as quatro variáveis independentes, enquanto que HS, ZP e PI foram estabelecidas como variáveis dependentes. O desenho fatorial 23x31 construído levou à otimização dos níveis alto (+1) e baixo (-1), com testes em triplicata para o nível central (0), produzindo assim trinta e três formulações e levando à seleção dos parâmetros processuais otimizados como sendo 0,015% (m/m) de entidade proteica (nível alto, +1), 0,75% (m/m) de emulsificante lipofílico (lecitina de soja) (nível alto, +1) e 0,50% (m/m) de emulsificante hidrofílico (poloxâmero 188) (nível baixo, -1). Assim, o planejamento fatorial estatístico levou à produção de uma emulsão ótima possuindo partículas essencialmente homogêneas com tamanho hidrodinâmico médio (n=3) de (186,2 ± 2,6) nm e potencial Zeta médio igual a (-36,5 ± 0,9) mV, e exibindo um índice de polidispersividade igual a 0,206 ± 0,014. Estes valores foram obtidos para um parâmetro processual de velocidade de homogeneização de 12500 rpm. Estas variáveis foram críticas para a produção de dispersões estáveis de nanogotas lipídicos com núcleo aquoso, permitindo a estabilização da emulsão por 180 dias em armazenamento a 4 °C. As variáveis de resposta HS, PI e ZP não exibiram qualquer correlação entre elas, como pode ser concluído a partir dos coeficientes de correlação e p-valores obtidos para PI vs. ZP (r = 0,205, p-valor = 0,338; p-valor > 0,05, pelo que não existe correlação significativa entre PI e ZP), PI vs. HS (r = 0,277, p-valor = 0,191; p-valor > 0,05, pelo que não existe correlação significativa entre PI e HS) e HS vs. ZP (r = -0,360, p-valor = 0,084; p-valor > 0,05, pelo que não existe correlação significativa entre HS e ZP). Desta forma, estas variáveis puderam ser analisadas individualmente, isto é, uma análise de variância (ANOVA) foi realizada para cada uma delas. Caso contrário, se tivessem sido encontradas quaisquer correlações estre estas variáveis de resposta, teria de ser realizada uma análise de variância multivariada (MANOVA). Conclusões: A partir das análises estatísticas realizadas, pode ser concluído que a formulação ótima para a encapsulação de entidades proteicas foi a emulsão ME25 (ou ME03/12500rpm).Introduction: The stabilization of bioactive entities is particularly relevant in the light of various applications in different areas such as pharmaceutical, food, cosmetics, (bio)medical and biotechnological. Specifically, the stabilization of protein entities for the preservation of both structure and functionality during storage, with such stabilization being achieved primarily through the establishment of a thermodynamic equilibrium between the (bio)entities and their (micro)environment. A nanostructured system of the type W/O/W emulsion prepared with a view to stabilizing protein entities is by nature a thermodynamically unstable system. Optimization, by means of a statistical experimental design, of the multiple process variables which enables production of such a system with stable characteristics over an extended storage period is therefore of paramount importance. There is a delicate balance between stability and flexibility necessary for the function of the biomolecule, added to the increased knowledge of the importance of the surface of the protein molecules to their stability, since it is through this interface that the protein moiety interacts with the "outside world". It is generally accepted that the functional importance of amino acid residues is related to their accessibility to solvent on the surface of the protein, whereas the structural importance of these amino acid residues is related to their location as part of the (hydrophobic) core of the protein. Objectives: The main objective of this applied research work consisted in the development of a nanostructured system of the type water-in-oil-in-water (W/O/W) emulsion and its statistical optimization for encapsulation of a protein entity, since, due to their compartmentalized internal structure, nanoemulsions of the type W/O/W possess clear advantages for the structural and functional stabilization of these biomolecules. Methods: A full experimental factorial design of the type 23x31 (3 factors into two levels, low and high, and one factor in three levels) to evaluate the influence of four factors on the physicochemical properties of W/O/W emulsions. The factors (independent variables) under scrutiny were (i) concentration of model protein (collagen) on two levels, low (-1) and high (+1); concentration of lipophilic surfactant (soya lecithin) on two levels, low (-1) and high (+1); concentration of hydrophilic surfactant (poloxamer 188) on two levels, low (-1) and high (+1); and homogenization stirring speed on three levels, low (7500 rpm), medium (10,000 rpm) and high (12,500 rpm). The dependent variables evaluated were the average particle hydrodynamic size (HS), the polydispersity index (PI) and Zeta Potential (ZP). Combination of the four factors resulted in a total of 24 "treatments" (24 mixtures). Additionally, the center points of the first three factors were also inserted, which, combined with the three levels of homogenization stirring speed, resulted in three additional treatments that were replicated three times each. The designed factorial planning thus originated the production of a total of 33 emulsions of the type W/O/W, via combination of the four aforementioned factors, which were characterized physico-chemically by determining, throughout storage time, the average particle hydrodynamic size (HS), the particle size distribution (PI), and surface charge of the particles by measuring the Zeta Potential (ZP). The variables HS, PI and ZP were measured in triplicate for each mixture, and the average values were considered for performing the statistical analysis of the results. For the optimal formulation, additional analyzes were also carried out via FTIR, XRD, cryo-TEM, TGA and DSC. The encapsulation efficiency of the statistically optimized emulsion was also determined, and its stability over a storage period of one year was also fully statistically analyzed. Results and Discussion: The concentrations of protein and both hydrophilic and lipophilic emulsifiers, and the homogenization stirring speed, were set as the four independent variables, whereas HS, ZP and PI were established as dependent variables. The 23x31 factorial design built led to the optimization of high (+1) and low (-1) levels, with tests in triplicate for the central level (0), thus producing thirty-three formulations and leading to the selection of optimized process parameters as 0.015% (w/w) protein moiety (high level, +1), 0.75% (w/w) lipophilic emulsifier (soya lecithin) (high level, +1) and 0.50% (w/w) hydrophilic emulsifier (poloxamer 188) (low level, -1). Thus, the statistical experimental design led to the production of an optimal emulsion possessing essentially homogeneous particles with an average (n=3) hydrodynamic size of (186.2 ± 2.6) nm and an average Zeta potential equal to (-36.5 ± 0 9) mV, and exhibiting a polydispersity index of 0.206 ± 0.014. These values were obtained for a homogenization stirring speed processing parameter of 12,500 rpm. These variables were critical for producing stable dispersions with aqueous-core lipid nanodrops, allowing the stabilization of the emulsion for 180 days of storage at 4 °C. The response variables HS, ZP and PI exhibited no correlation whatsoever between them, as can be concluded from the correlation coefficients and p-values obtained for PI vs. ZP (r = 0.205, p = 0.338; p-value> 0.05, so there is no significant correlation between PI and ZP), PI vs. HS (r = 0.277, p = 0.191; p-value> 0.05, so there is no significant correlation between PI and HS) and HS vs. ZP (r = -0.360, p-value = 0.084; p-value> 0.05, so there is no significant correlation between HS and ZP). Thus, these variables could be analyzed individually, i.e., an analysis of variance (ANOVA) was performed for each one of them. Otherwise, if any correlations whatsoever had been found between these response variables, a multivariate analysis of variance (MANOVA) would be in order. Conclusions: From the statistical analyzes performed, it can be concluded that the optimal formulation for encapsulation of protein entities was ME25 emulsion (or ME03/12500rpm).EmulsõesTecnologia farmacêuticaFarmacologiaAnálise de variânciaDissertação