PneumoPhageSensing: desenvolvimento de um biossensor para pseudomonas aeruginosa com base em partículas bacteriofágicas estritamente líticas

O uso indiscriminado dos antibióticos, aliado à enorme capacidade adaptativa das bactérias, possibilitou o surgimento de cepas bacterianas com variáveis e crescentes níveis de resistência aos mesmos. Tal resistência limita a eficácia do arsenal terapêutico disponível para o tratamento contra infecções por cepas multirresistentes. Esta realidade tem provocado dificuldades acrescidas no controle das infecções, contribuindo tanto para o aumento dos custos do sistema de saúde e das unidades de cuidados de saúde, como tem graves consequências para a saúde dos pacientes, prolongando o tempo de permanência nestas unidades e elevando os custos a ela associados. Além disto, contribuiu significativamente para a morbidade e mortalidade de pacientes hospitalizados. Sendo assim, as infecções hospitalares representam um grande desafio a ser enfrentado tanto pelo poder público como pela sociedade, na execução de ações de prevenção e controle de infecções nas unidades de cuidados de saúde. Dentre os microrganismos causadores de infecções hospitalares pode destacarse a Pseudomonas aeruginosa, bactéria oportunista que representa grande ameaça a pacientes nos serviços de saúde. O presente trabalho de pesquisa teve como objetivo desenvolver um sistema de biodetecção da bactéria Pseudomonas aeruginosa, com base no uso de um biohidrogel cromogênico sensível a alterações de cor, contendo um coquetel de partículas bacteriofágicas específicas e estritamente líticas, isoladas de fontes ambientais. As partículas fágicas isoladas foram extensamente caracterizadas tanto fisicoquímica como biologicamente. Os bacteriófagos isolados pertencem à ordem Caudovirales uma vez que têm cauda, com os fagos ph0031 e ph0034 a pertencerem, provavelmente, à família Myoviridae, e o fago ph0041 a pertencer, provavelmente, à família Siphoviridae, com tamanhos de genoma estimados em 62.5 kbp (fago ph0031), 106.9 kbp (fago ph0034) e 44.5 kbp (fago ph0041), com todos os fagos a serem capazes de se ligarem a várias estirpes de P. aeruginosa provenientes de isolados clínicos e levarem à sua morte. Os fagos ph0034 e ph0041 parecem ser bastante rápidos a lisarem o hospedeiro, com tamanhos de explosão de 20 UFP/célula hospedeira (fago ph0031), 28.3 UFP/célula hospedeira (fago ph0034) e 84.2 UFP/célula hospedeira (fago ph0041), indicando que se replicam eficientemente em P. aeruginosa com curtos períodos de latência (30 min, 10 min e 30 min para os fagos ph0031, ph0034 e ph0041, respetivamente). Os fagos isolados causaram uma elevada redução no crescimento de células de P. aeruginosa, mas os seus efeitos ocorrem apenas após as primeiras 8 h de incubação. Para o desenvolvimento de um sistema de biodetecção bacteriana, duas abordagens foram seguidas, integrando reagentes específicos numa matriz biopolimérica, em concentrações variáveis, com o objetivo de produzir sinal colorimétrico/bioluminescente em presença de um determinado componente citoplasmático liberado por lise fágica de células de Pseudomonas aeruginosa em contato com a matriz cromogênica. As partículas fágicas imobilizadas mostraram-se viáveis e mantiveram sua atividade lítica após o processo de polimerização que conduziu aos hidrogéis cromogênicos biorreativos, permitindo assim concluir que a estabilização tanto da sua estrutura como da sua função foi plenamente atingida. Usando o sistema de biodetecção I, para números de células bacterianas até 107 UFC nenhuma mudança visível na cor pode ser observada além de 180 min de ensaio, permitindo inferir que a presença desta bactéria num fluído poderia ser detectada dentro de um período de ensaio de 3 h usando este biossensor. Utilizando o sistema de biodetecção II, desenvolveu-se bioluminescência após contato da bactéria com o hidrogel. A partir dos sinais de bioluminescência capturados pelo sensor LDR, quatro momentos principais puderam ser definidos, estando estes em estreita concordância com a duração geral de um ciclo lítico, e permitiram detectar positivamente uma carga bacteriana de P. aeruginosa num período de tempo inferior a 180 min. Com relação ao sinal proveniente do sensor de estado sólido (fotodiodo), ele foi um tanto errático sem uma correspondência clara com o sinal do sensor LDR e, portanto, o sensor fotodiodo foi considerado não adequado para o propósito pretendido do sistema de biodetecção bacteriana II. Os resultados obtidos neste trabalho de pesquisa permitem concluir que ambos os dispositivos de biossensor foram capazes de detectar positivamente a presença de células de P. aeruginosa dentro de um período de ensaio de 3 h. Hidrogéis cromogênicos biorreativos facilitam o manuseio e, portanto, são desejáveis ao projetarse um sistema integrado de biodetecção bacteriana de utilização prática. Neste caso, os hidrogéis biorreativos aprisionando partículas bacteriofágicas e exibindo características cromogênicas / bioluminescentes foram utilizados com sucesso para detectar células de P. aeruginosa supostamente presentes em fluídos biológicos dentro de um intervalo de tempo de 180 min e, portanto, exibem potencial para uso em (mas não limitado a) ambientes hospitalares.