Navegando por Assunto "Emulsões"
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- DissertaçãoOtimização da metodologia de preparação de emulsões do tipo A/O/A integrando nanogotas lipídicas com núcleo aquoso, para estabilização proteica(2016) Glasser, Cássia AntunesIntrodução: A estabilização de entidades bioativas assume particular relevância em função das diversas aplicações em distintas áreas como a farmacêutica, a alimentar, a de cosméticos, a (bio)médica e a biotecnológica. Especificamente, a estabilização de entidades proteicas com vista à preservação tanto da estrutura como da funcionalidade durante o armazenamento, sendo essa estabilização conseguida principalmente através do estabelecimento de um equilíbrio termodinâmico entre as (bio)entidades e o seu (micro)ambiente. Um sistema nanoestruturado do tipo emulsão A/O/A preparado com vista a estabilização de entidades proteica é por natureza um sistema termodinamicamente instável. A otimização, por via de um planejamento fatorial estatístico, das várias variáveis processuais que permita a produção de tal sistema com características estáveis ao longo de um período alargado de armazenamento é, por isso, de suma importância. Existe um delicado equilíbrio entre a estabilidade e a flexibilidade necessárias à função das biomoléculas, a que se soma o aumento do conhecimento da importância da superfície das moléculas proteicas para a sua estabilidade, uma vez que é através desta interface que a entidade proteica interage com o "mundo externo". É geralmente aceito que a importância funcional dos resíduos de aminoácidos está relacionada com a sua acessibilidade a solventes na superfície da proteína, enquanto que a importância estrutural desses resíduos de aminoácidos está relacionada com a sua localização como parte do núcleo (hidrofóbico) da proteína. Objetivos: O objetivo principal deste trabalho de pesquisa aplicada consistiu no desenvolvimento de um sistema nanoestruturado do tipo emulsão água-em-óleo-em-água (A/O/A) e na sua otimização estatística para encapsulação de uma entidade proteica, uma vez que, devido à sua estrutura interna compartimentalizada, as nanoemulsões do tipo A/O/A apresentam claras vantagens para a estabilização estrutural e funcional dessas biomoléculas. Métodos: Foi desenhado um planejamento fatorial experimental completo do tipo 23x31 (3 fatores em 2 níveis, inferior e superior, e 1 fator em três níveis), para avaliar a influência de quatro fatores nas propriedades físicoquímicas de emulsões do tipo A/O/A. Os fatores (variáveis independentes) sob escrutínio foram (i) concentração de proteína modelo (colágeno) em dois níveis, baixo (-1) e alto (+1); concentração de surfactante lipofílico (lecitina de soja) em dois níveis, baixo (-1) e alto (+1); concentração de surfactante hidrofílico (poloxâmero 188) em dois níveis, baixo (-1) e alto (+1); e velocidade de homogeneização em três níveis, baixo (7500 rpm), médio (10000 rpm) e alto (12500 rpm). As variáveis dependentes avaliadas foram o tamanho hidrodinâmico (HS) médio de partícula, o índice de polidispersão (PI) e o Potencial Zeta (ZP). A combinação dos quatro fatores resultou num total de 24 “tratamentos” (24 misturas). Adicionalmente, os pontos centrais dos três primeiros fatores foram também inseridos, os quais, combinados com os três níveis de velocidade de homogeneização, resultaram em três tratamentos adicionais que foram replicados três vezes cada. O planejamento fatorial desenhado originou assim a produção de um total de 33 emulsões do tipo A/O/A, por combinação dos quatro fatores, as quais foram caracterizadas fisico-quimicamente através da determinação, ao longo do tempo de armazenamento, do tamanho hidrodinâmico de partícula (HS), distribuição de tamanhos de partícula (PI) e carga superficial das partículas através da determinação do Potencial Zeta (ZP). As variáveis HS, PI e ZP foram medidas em triplicata, para cada mistura, e os valores médios foram considerados para as análises estatísticas dos resultados. Para a formulação ótima, foram ainda realizadas análises por FTIR, DRX, crio-MET, TGA e DSC. Foi ainda determinada a eficiência de encapsulação da emulsão otimizada estatisticamente, bem como analisada estatisticamente a sua estabilidade ao longo de um período de armazenamento de um ano. Resultados e Discussão: As concentrações de proteína e dos emulsificantes lipofílico e hidrofílico, e a velocidade de homogeneização, foram estabelecidas como as quatro variáveis independentes, enquanto que HS, ZP e PI foram estabelecidas como variáveis dependentes. O desenho fatorial 23x31 construído levou à otimização dos níveis alto (+1) e baixo (-1), com testes em triplicata para o nível central (0), produzindo assim trinta e três formulações e levando à seleção dos parâmetros processuais otimizados como sendo 0,015% (m/m) de entidade proteica (nível alto, +1), 0,75% (m/m) de emulsificante lipofílico (lecitina de soja) (nível alto, +1) e 0,50% (m/m) de emulsificante hidrofílico (poloxâmero 188) (nível baixo, -1). Assim, o planejamento fatorial estatístico levou à produção de uma emulsão ótima possuindo partículas essencialmente homogêneas com tamanho hidrodinâmico médio (n=3) de (186,2 ± 2,6) nm e potencial Zeta médio igual a (-36,5 ± 0,9) mV, e exibindo um índice de polidispersividade igual a 0,206 ± 0,014. Estes valores foram obtidos para um parâmetro processual de velocidade de homogeneização de 12500 rpm. Estas variáveis foram críticas para a produção de dispersões estáveis de nanogotas lipídicos com núcleo aquoso, permitindo a estabilização da emulsão por 180 dias em armazenamento a 4 °C. As variáveis de resposta HS, PI e ZP não exibiram qualquer correlação entre elas, como pode ser concluído a partir dos coeficientes de correlação e p-valores obtidos para PI vs. ZP (r = 0,205, p-valor = 0,338; p-valor > 0,05, pelo que não existe correlação significativa entre PI e ZP), PI vs. HS (r = 0,277, p-valor = 0,191; p-valor > 0,05, pelo que não existe correlação significativa entre PI e HS) e HS vs. ZP (r = -0,360, p-valor = 0,084; p-valor > 0,05, pelo que não existe correlação significativa entre HS e ZP). Desta forma, estas variáveis puderam ser analisadas individualmente, isto é, uma análise de variância (ANOVA) foi realizada para cada uma delas. Caso contrário, se tivessem sido encontradas quaisquer correlações estre estas variáveis de resposta, teria de ser realizada uma análise de variância multivariada (MANOVA). Conclusões: A partir das análises estatísticas realizadas, pode ser concluído que a formulação ótima para a encapsulação de entidades proteicas foi a emulsão ME25 (ou ME03/12500rpm).
- DissertaçãoPneumoPhageKill: estabilização estrutural e funcional de partículas bacteriofágicas em emulsões do tipo A/O/A : sistema bioterapêutico para tratamento de pneumonia bacteriana por nebulização(2016) Rios, Alessandra CândidaA terapia fágica, através da aplicação de partículas bacteriofágicas (PBs) estritamente líticas para a bactéria alvo hospedeira diretamente no local da infecção, tem sido proposta como uma potencial alternativa/complemento aos antibióticos convencionais. As principais vantagens das PBs no tratamento de infecções bacterianas residem na manutenção de uma elevada concentração de PBs no local da infecção enquanto existirem células bacteriana salvo viáveis, na sua elevada especificidade, e na produção de enzimas específicas (holinas e lisinas) que hidrolisam a matriz polimérica dos biofilmes bacterianos, favorecendo assim a sua penetração e ação antibacteriana. Uma alternativa para a veiculação das PBs de forma a manter sua estrutura e funcionalidade viáveis reside no encapsulamento no núcleo aquoso interno de nanovesículas lipídicas integrando sistemas de emulsão múltipla do tipo águaem-óleo-em-água (A/O/A), pois existe um delicado equilíbrio entre a estabilidade e a flexibilidade necessárias à função das biomoléculas associado à importância da superfície das moléculas de natureza proteica para a sua estabilidade, uma vez que é através desta interface que a entidade proteica interage com o microambiente que a rodeia. O objetivo principal deste trabalho consistiu na investigação do potencial de nanoencapsulamento e proteção de PBs estritamente líticas para Pseudomonas aeruginosa, com consequente estabilização estrutural e funcional de tais entidades. Foram produzidas emulsões múltiplas do tipo A/O/A pelo método de emulsificação em duas etapas, integrando PBs encapsuladas no núcleo aquoso interno das nanovesículas lipídicas constituintes da emulsão múltipla, e formuladas soluções isotônicas com vista à sua administração por nebulização. A propagação das PBs na suspensão estoque no seu hospedeiro bacteriano específico (P.aeruginosa) resultou numa suspensão concentrada de PBs com concentração média igual a (2.983±0.416)x109 viriões mL-1. Três emulsões múltiplas A/O/A foram produzidas, com 10 µL ou 1000 µL de suspensão concentrada de PBs na fase aquosa interna ou com 10 µL de uma mistura de LB-top ágar (4 mL) e tampão fágico (3 mL) na fase aquosa interna (emulsão múltipla placebo). Uma maior quantidade de PBs não provocou quaisquer alterações nos valores de Potencial Zeta (ZP) mas amplificou as propriedades antibacterianas da emulsão múltipla. A eficiência de encapsulação (EE) de PBs da emulsão ME1000 foi EE=89.2%. É digno de nota lembrar que esta eficiência de encapsulação está relacionada apenas com viriões de fagos, uma vez que as leituras de absorbância foram feitas por forma a excluir os detritos celulares e quaisquer outras proteínas intracitoplasmáticas liberadas pela lise celular bacteriana. O coeficiente de difusão das nanovesículas lipídicas integrantes da ME1000 foi calculado através da equação de Stokes-Einstein e produziu o valor de 2.607x10-12 m2.s-1, comparável e da mesma ordem de grandeza (10-12 m2.s-1) que os resultados publicados por vários outros pesquisadores. Devido às muito baixas quantidades de ME1000 adicionadas à solução salina, as misturas resultantes eram já naturalmente isotônicas e adequadas para administração via nebulização. Dado que o volume normalmente projetado durante um jato de nebulização é da ordem de grandeza de 500 µL, e porque (pelo menos em teoria) uma única PB seria suficiente para erradicar completamente uma infecção bacteriana, todas as soluções isotônicas testadas seriam altamente eficazes na erradicação de uma infecção bacteriana pulmonar por Pseudomonas aeruginosa. Com base nos resultados obtidos pelos testes de viabilidade celular (MTT e citometria de imagem), é possível argumentar que as soluções isotônicas testadas e preparadas com o sistema ME1000 exibiram uma boa viabilidade celular e baixa citotoxicidade, não possuindo características que promovessem lesões no DNA. Uma importante contribuição para a elevada estabilidade dos sistemas de emulsão múltipla produzidos com PBs (estritamente líticas) encapsuladas foi muito provavelmente os valores muito negativos de ZP obtidos para a ME1000, promovendo repulsão eletrônica das partículas e mantendo-as em suspensão, também corroborado pelo coeficiente de difusão calculado para as nanovesículas lipídicas integrantes da emulsão múltipla (2.607x10-12 m2.s-1), com ordem de grandeza relacionada com a estabilidade de uma emulsão múltipla. Porque o aprisionamento de entidades proteicas bioativas (tais como as PBs) promove uma alteração nas condições termodinâmicas do nanoambiente que rodeia cada partícula e, devido ao fato de que os movimentos das moléculas de solvente (aquoso) na sua microvizinhança ficam seriamente reduzidos pelo efeito de estarem contidos no seio do núcleo aquoso da matriz, o resultado final é uma estabilidade termodinâmica aumentada com potenciação da viscosidade rotacional, translacional e vibracional das PBs, promovendo uma arquitetura tri-dimensional mais rígida com consequente decréscimo da entropia e promovendo assim a estabilização estrutural e funcional das PBs. Para as linhagens celulares testadas, as soluções isotônicas integrando a ME1000 não exibiram efeitos genotóxicos significativos às três concentrações de ME1000 testadas (i.e., 0.3%, 0.6% e 0.9%, v/v), o que está em perfeita concordância com a ausência de efeitos citotóxicos observados para ambas as linhagens celulares. O uso da ME1000 na formulação de uma solução isotônica para nebulização no tratamento de infecções bacterianas pulmonares por P. aeruginosa possuiria vantagens inerentes, quando comparado com as formulações químicas antimicrobianas convencionais, uma vez que PBs específicas e estritamente líticas são predadores naturais e auto-replicantes das bactérias sendo virtualmente inofensivas tanto para células como tecidos humanos.