Pós-Graduação Stricto Sensu

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Avaliação das atividades antioxidante e antimicrobiana da curcumina e do pirocatecol na manutenção da qualidade do biodiesel
(2015) Santos, Gustavo Alexandre dos
Introdução: O biodiesel tem sido empregado por vários países visando minimizar os efeitos da emissão de gases poluentes, e provou ser um bom substituto para o diesel derivado do petróleo por causa de sua melhor biodegradabilidade e mais baixa emissão de dióxido de carbono. Devido à sua higroscopicidade, pode ocorrer acúmulo de água durante o armazenamento de biodiesel por longos períodos de tempo, o que favorece a oxidação lipídica e a proliferação de microrganismos, com consequente perda de qualidade do biodiesel. Para controlar a contaminação microbiana durante a estocagem do biodiesel, tem-se observado o emprego de diversas substâncias químicas com atividade biocida. Objetivos: Neste trabalho de pesquisa objetivou-se avaliar as atividades antioxidante e antimicrobiana das substâncias naturais curcumina (CC) e pirocatecol (PC) na manutenção da qualidade do biodiesel produzido a partir de diversas fontes vegetais. Método: Foram testadas várias concentrações mássicas de CC e de PC, entre 0-1,5% (m/m), na ausência e na presença de água adicionada (1%, m/m), para determinação da concentração mínima específica de agente natural com efeito fungistático para cada biodiesel. Amostras dos vários biodieseis foram então preparadas por adição de quantidades variáveis de CC ou de PC, sem e com adição de água, e a atividade antimicrobiana de cada concentração testada por aplicação dos correspondentes biodieseis em culturas em tapete de Paecilomyces variotii Bainier previamente preparadas, permitindo assim determinar, após incubação, qual a melhor substância natural e quais as mínimas concentrações que produziram efeito fungistático no biodiesel. Essas concentrações mínimas de CC foram adicionadas a cada um dos biodieseis, na presença de 1% (m/m) de água adicionada, tendo os biodieseis sido inoculados deliberadamente com o mesmo fungo filamentoso e armazenados em frascos âmbar envolvidos com papel de alumínio, a 25 °C. Cada biodiesel foi então analisado ao longo do tempo de armazenamento, a intervalos pré-determinados de 0, 30, 60, 90, 120, 150 e 180 dias, quanto ao índice de refração, tempo de indução da oxidação lipídica e presença de células viáveis do fungo filamentoso. Resultados e Discussão: A adição combinada de 1% (m/m) de água e uma baixa concentração mássica de CC (i.e., 0,2% (m/m) para o biodiesel de óleo residual de fritura, 0,5% (m/m) para o biodiesel de óleo de soja, 0,1% (m/m) para o biodiesel de óleo de semente de algodão, 0,5% (m/m) para o biodiesel de óleo de semente de gergelim, 0,2% (m/m) para o biodiesel de óleo de amêndoa de macaúba, e 0,2% (m/m) para o biodiesel de óleo de microalgas) foram aquelas variáveis processuais que promoveram a melhor inibição do crescimento microbiano. Os tempos médios de indução da oxidação lipídica dos biodieseis adicionados com quantidades variáveis (mínimas) de CC e 1% (m/m) de água sofreram um aumento generalizado quando comparados com os dos seus homólogos puros. Exceto para o biodiesel produzido a partir de óleo de soja, que sofreu uma redução de 16% no tempo de indução da oxidação lipídica após adição de CC, significando que este biodiesel foi mais suscetível à oxidação após a adição combinada de água e CC, todos os outros biodieseis provaram ser mais resistentes à oxidação, com aumentos significativos nos seus tempos de indução da oxidação lipídica. Adicionalmente, o biodiesel puro produzido a partir do óleo de amêndoa de macaúba provou ser muito resistente à oxidação, exibindo períodos de indução da oxidação lipídica superiores a 60 h, tornando irrelevante a adição de qualquer antioxidante. Ainda mais, a adição de CC a este biodiesel catapultou a indução da oxidação lipídica para mais de 140 h. Assim, este biodiesel foi descontinuado dos estudos subsequentes. O mesmo aconteceu ao biodiesel produzido a partir de óleo de microalgas, devido à dificuldade de obtenção em grandes quantidades deste biodiesel ainda experimental. Estes resultados demonstram claramente o potencial da adição da CC aos biodieseis na prevenção tanto da oxidação como do crescimento microbiano. Exceto para o biodiesel produzido a partir de óleo residual de fritura, no qual se verificou uma marcada diminuição na estabilidade oxidativa ao longo de todo o período de armazenamento, todos os outros biodieseis provaram ser mais resistentes à oxidação após a adição de CC, exibindo apenas ligeiros decréscimos ao longo do tempo nos seus tempos de indução da oxidação lipídica. O biodiesel produzido a partir de óleo de semente de gergelim exibiu uma elevada estabilidade oxidativa, que se manteve ao longo de todo o período de armazenamento. A ligeira/marginal tendência de aumento do índice de refração durante o armazenamento dos vários biodieseis reflete a manutenção das suas propriedades físicas, o que foi confirmado pela estabilidade oxidativa atingida após a adição de CC a todos os biocombustíveis. Os biodieseis adicionados com CC mantiveram um ambiente hostil que impediu o crescimento microbiano, o que foi confirmado pelos resultados negativos obtidos através da pesquisa microbiológica para a presença de células microbianas viáveis ao longo de todo o período de armazenamento. Conclusões: A CC, em baixas concentrações mássicas, foi capaz de aumentar substancialmente os tempos de indução da oxidação lipídica de todos os biodieseis testados, providenciando estabilidade oxidativa, assim como manter ambientes hostis para fungos filamentosos contaminantes de distribuição ubíqua, como é o caso do Paecilomyces variotii Bainier. Adicionalmente, a suave tendência de aumento apenas no quarto algarismo significativo dos valores dos índices de refração de todos os biodieseis permite afirmar que as suas características iniciais se mantiveram preservadas após a adição de CC e água.
(Bio)2 - Sistema híbrido bioinspirado e biomimético à base de nanocelulose de origem microbiana e líquido iônico, para estabilização e entrega transdérmica de insulina
(2019) Jorge, Ludmilla Rodrigues Ribeiro
INTRODUÇÃO: Sistemas bioinspirados e biomiméticos à base de filmes biopoliméricos são interessantes para utilização farmacêutica em função de características como biocompatibilidade, biodegrabilidade, toxicidade quase nula e adequadas propriedades fisicoquímicas. A permeação tópica de fármacos pode ser otimizada através da incorporação de substâncias facilitadoras da permeação cutânea. Neste sentido, os líquidos iônicos são substâncias promissoras. A insulina é um hormônio que tem como função manter os níveis normais de glicose no sangue. A ausência ou produção parcial desse hormônio gera a hiperglicemia ou Diabetes Melittus (DM), doença crônica com elevada prevalência. Para o tratamento da DM tipo 1 é imprescindível o uso de insulina, a qual é administrada por aplicações subcutâneas. OBJETIVO: Desenvolver e avaliar um filme polimérico base de nanocelulose de origem microbiana e goma xantana para entrega tópica de insulina, tendo um liquido iônico como facilitador da permeação cutânea. MÉTODOS EXPERIMENTAIS: A nanocelulose bacteriana foi produzida por fermentação da bactéria Gluconacetobacter hansenii ATCC®23769, incorporada com insulina e caracterizada por adsorção de insulina, FTIR, XRD, DSC e TGA, FESEM, resistência mecânica, citotoxicidade, genotoxicidade e ensaio de permeação transdérmica via célula de Franz. Realizou-se a síntese e caracterização dos líquidos iônicos por citotoxidade, genotoxicidade, FTIR, TGA e DSC, teor de água, 1HRMN. Seguiu-se a produção e caracterização dos biofilmes com nanocelulose e goma xantana, integrando insulina e geranto de colina. A caracterização dos filmes foi realizada pelos ensaios de resistência mecânica, TGA e DSC, XRT e DESEM. Por fim, avaliou-se a capacidade de permeação transdérmica da insulina pelo ensaio de permeação em células de Franz. RESULTADOS E DISCUSSÃO: As biomembranas de nanocelulose produzidas mostraram-se seguras para a aplicação sobre a pele, com adequadas propriedades mecânicas. Foram obtidos líquidos iônicos com reduzida citotoxicidade e genotoxicidade nula. O filme biopolimérico desenvolvido apresentou adequadas propriedades fisico-quimicas e biológicas, com efetiva capacidade de permeação transdérmica da insulina. CONCLUSÃO: Obteve-se um bifilme polimérico com excelentes propriedades mecânicas, físico-quimicas e biológicas, com capacidade de liberação e permeação transdérmica de insulina. Deste modo, o produto desenvolvido apresenta potencial para a entrega de insulina através da pele humana por permeação transdérmica.
Estabilização estrutural e funcional de sericina em filme biopolissacarídico: bio-origami para a regeneração de pele
(2018) Rocha, Liliam Katsue Harada
Hidrogéis são estruturas formadas por redes tridimensionais de polímeros hidrofílicos reticulados, intumescendo em contato com água mas mantendo sua integridade estrutural. Os hidrogéis biopoliméricos são bastante interessantes para utilização em regeneração de pele e no tratamento de feridas cutâneas, como curativos, devido a muitos fatores, incluindo a sua baixa toxicidade. Na preparação de hidrogéis, utilizam-se polímeros tanto naturais como sintéticos, polimerizados por diferentes processos. Neste projeto de pesquisa, optouse pela utilização dos biopolissacarídeos goma xantana e carragenana, além da utilização da proteína sericina, que foi incorporada nos filmes como princípio ativo. A sericina é uma proteína globular bioativa, constituindo entre 25-30% (m/m) das proteínas da seda. Devido às suas propriedades bioquímicas e biofísicas exclusivas, a sericina tem sido estudada para várias potenciais aplicações. Este trabalho de pesquisa teve como objetivo desenvolver e avaliar um filme biopolimérico integrando sericina (bio-origami), com propriedades mecânicas adequadas, com potencial de regeneração cutânea. A sericina, extraída do casulo do bicho da seda (Bombyx mori) por dois processos distintos, foi comparada ao seu padrão e caracterizada por diferentes métodos, tanto do ponto de vista físicoquímico como biológico. Seguindo-se à caracterização da sericina, produziram-se os filmes biopoliméricos (bio-origamis) para estabilização estrutural e funcional de sericina, com recurso a um planejamento fatorial completo do tipo 32 (2 variáveis (% (m/m) de goma xantana e % (m/m) de carragenana) em 3 níveis ((-1), (0) e (+1)), com polimerização realizada por adição de álcool polivinílico (PVA) (98% hidrolizado) a 1,25% (m/v), e com adição de glicerol até 2,50% (m/v) em todas elas, para indução de efeito plastificante nas formulações, originando assim um total de 09 formulações. Para a matriz de filme biopolimérico otimizado estatisticamente, a incorporação de sericina foi avaliada na formulação ótima em termos de composição biopolissacarídica, nos níveis de 0, 1, 2, 5, 10, 20 e 50 mgsericina/mLhidrogel. Os filmes bioorigami obtidos foram avaliados considerando a capacidade de liberação da entidade proteica bioativa (sericina), através de testes de permeação, assim como por testes de caracterização tanto físicoquímica como biológica. As duas técnicas de extração utilizadas para a produção dos extratos da proteína sericina apresentaram rendimentos relativamente semelhantes. No processo de caracterização biológica, os extratos de sericina apresentaram-se atóxicos e com atividade antimicrobiana positiva para cepas de Staphylococcus aureus. Na análise de atividade antioxidante, a sericina obtida pela técnica de extração por liofilização apresentou maior atividade antioxidante. A composição matricial do filme biopolimérico de escolha obtido pela otimização estatística foi aquela correspondendo ao nível (+1) (0), por resultar em um filme mais forte e elástico. Os resultados obtidos a partir da caracterização do filme bio-origami otimizado, integrando diferentes concentrações de sericina, evidenciam que a proteína sericina foi estabilizada tanto estruturalmente como funcionalmente, com o bio-origami dotado de efeitos de eliminação de radicais livres e capacidade de liberação prolongada da proteína bioativa, sugerindo assim uma potencial aplicação biofarmacêutica para a regeneração de pele.
Isolamento, caracterização e avaliação in vitro de bacteriófagos líticos para o biocontrole de salmonella enterica
(2021) Oliveira, Thais Jardim
A maioria das doenças transmitidas por alimentos são causadas por microrganismos, sendo um dos principais agentes patogênicos a bactéria Salmonella enterica. Tratamentos como vapor, calor seco e luz UV têm sido avaliados para o controle dos principais agentes causadores de intoxicações alimentares. Entretanto, nem sempre as atuais tecnologias utilizadas para inativar agentes patogênicos nos alimentos são efetivas. Além disso, podem ocasionar problemas de aceitabilidade e deterioração das propriedades organolépticas dos alimentos. Neste contexto, os bacteriófagos (ou fagos) emergiram como potencial ferramenta para o biocontrole de bactérias patogênicas. O trabalho de pesquisa aqui apresentado objetivou isolar e caracterizar fagos líticos para S. enterica. Para o isolamento dos fagos, buscou-se águas residuais da indústria de alimentos “AB Brasil - Indústria e Comércio de Alimentos, Ltda”. A caracterização físico-química das partículas bacteriofágicas isoladas incluiu: varredura espectral em UV-Vis, determinação dos coeficientes de extinção molar, análises das proteínas estruturais por SDS-PAGE (eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecilsulfato de sódio), caracterização morfológica por microscopia eletrônica de transmissão (MET). A caracterização biológica incluiu a avaliação da gama de hospedeiros utilizando diversas culturas bacterianas, determinação da eficiência de plaqueamento (EOP) em cepas bacterianas suscetíveis, determinação dos parâmetros de crescimento das partículas fágicas (período de eclipse, período latente, período de acumulação intracelular, e tamanho de explosão) através das curvas de um só ciclo de crescimento síncrono (OSGC), determinação da taxa de adsorção das partículas fágicas às células bacterianas hospedeiras através das de curvas de adsorção, e determinação da atividade lítica na cepa de coleção de S. enterica. Foram isoladas e caracterizadas duas partículas fágicas líticas contra S. entérica, tendo sido nomeadas como PhL_UNISO_SE_ph0036 e PhL_UNISO_SE_ph0046. Ambos os fagos mostraram atividade contra a bactéria hospedeira, mostrando serem altamente específicos, o que pode indicar uso promissor no controle biológico deste patógeno em alimentos.
Isolamento, caracterização, estabilização estrutural/funcional e avaliação in vitro, de um novo bacteriófago contra Klebsiella pneumoniae multirresistentes
(2020) Moreli, Fernanda de Campos
Os bacteriófagos são vírus que infectam única e especificamente bactérias, sendo totalmente desprovidos de atividade metabólica. Ao contrário dos agentes antibióticos de amplo espectro, que funcionam indiscriminadamente, os bacteriófagos visam especificamente apenas certas espécies/cepas de bactérias, e é precisamente esta especificidade que torna os bacteriófagos muito atrativos para o combate de infecções por bactérias multirresistentes aos antibióticos. O trabalho de pesquisa desenvolvido objetivou o isolamento (a partir de fontes ambientais) e caracterização de um novo bacteriófago com amplo espectro lítico capaz de infectar Klebsiella pneumoniae. Foram utilizadas fontes de esgoto hospitalar na região de Sorocaba (Brasil), para a pesquisa e isolamento de bacteriófagos líticos. A caracterização físico-química das partículas bacteriofágicas isoladas incluiu análises via verificação de lise bacteriana (em cepas de Klebsiella pneumoniae resistentes a antibióticos, provenientes de isolados clínicos), varredura espectral UV-Vis para determinação do coeficiente de extinção molar das partículas fágicas, DRX, eletroforese SDS-PAGE e MET, enquanto a caracterização biológica abrangeu a avaliação da sua gama de hospedeiros usando culturas bacterianas de Klebsiella pneumoniae tanto provenientes de coleção como de 26 isolados clínicos (humanos) assim como de outras espécies bacterianas provenientes de coleção, determinação da eficiência de plaqueamento (EOP), determinação da curva de crescimento em um só ciclo síncrono (OSGC) para cálculo do período latente, período de eclipse, período de acumulação intracelular e tamanho de explosão, determinação da curva de adsorção para cálculo da taxa de adsorção das partículas bacteriofágicas em sua célula hospedeira bacteriana, e avaliação da capacidade de inativação bacteriana in vitro pelas partículas fágicas utilizando valores de MOI de 1 e 1000. As partículas do bacteriófago isolado exibiram um amplo espectro lítico contra as cepas multirresistentes da bactéria em estudo. O uso do bacteriófago isolado possui vantagens inerentes pelo fato de ser um predador bacteriano natural, específico e estritamente lítico, que reconhece rápida e especificamente seu hospedeiro bacteriano, o que leva a um resultado cada vez mais difícil de obter com os antibióticos químicos atuais.
Otimização da metodologia de preparação de emulsões do tipo A/O/A integrando nanogotas lipídicas com núcleo aquoso, para estabilização proteica
(2016) Glasser, Cássia Antunes
Introdução: A estabilização de entidades bioativas assume particular relevância em função das diversas aplicações em distintas áreas como a farmacêutica, a alimentar, a de cosméticos, a (bio)médica e a biotecnológica. Especificamente, a estabilização de entidades proteicas com vista à preservação tanto da estrutura como da funcionalidade durante o armazenamento, sendo essa estabilização conseguida principalmente através do estabelecimento de um equilíbrio termodinâmico entre as (bio)entidades e o seu (micro)ambiente. Um sistema nanoestruturado do tipo emulsão A/O/A preparado com vista a estabilização de entidades proteica é por natureza um sistema termodinamicamente instável. A otimização, por via de um planejamento fatorial estatístico, das várias variáveis processuais que permita a produção de tal sistema com características estáveis ao longo de um período alargado de armazenamento é, por isso, de suma importância. Existe um delicado equilíbrio entre a estabilidade e a flexibilidade necessárias à função das biomoléculas, a que se soma o aumento do conhecimento da importância da superfície das moléculas proteicas para a sua estabilidade, uma vez que é através desta interface que a entidade proteica interage com o "mundo externo". É geralmente aceito que a importância funcional dos resíduos de aminoácidos está relacionada com a sua acessibilidade a solventes na superfície da proteína, enquanto que a importância estrutural desses resíduos de aminoácidos está relacionada com a sua localização como parte do núcleo (hidrofóbico) da proteína. Objetivos: O objetivo principal deste trabalho de pesquisa aplicada consistiu no desenvolvimento de um sistema nanoestruturado do tipo emulsão água-em-óleo-em-água (A/O/A) e na sua otimização estatística para encapsulação de uma entidade proteica, uma vez que, devido à sua estrutura interna compartimentalizada, as nanoemulsões do tipo A/O/A apresentam claras vantagens para a estabilização estrutural e funcional dessas biomoléculas. Métodos: Foi desenhado um planejamento fatorial experimental completo do tipo 23x31 (3 fatores em 2 níveis, inferior e superior, e 1 fator em três níveis), para avaliar a influência de quatro fatores nas propriedades físicoquímicas de emulsões do tipo A/O/A. Os fatores (variáveis independentes) sob escrutínio foram (i) concentração de proteína modelo (colágeno) em dois níveis, baixo (-1) e alto (+1); concentração de surfactante lipofílico (lecitina de soja) em dois níveis, baixo (-1) e alto (+1); concentração de surfactante hidrofílico (poloxâmero 188) em dois níveis, baixo (-1) e alto (+1); e velocidade de homogeneização em três níveis, baixo (7500 rpm), médio (10000 rpm) e alto (12500 rpm). As variáveis dependentes avaliadas foram o tamanho hidrodinâmico (HS) médio de partícula, o índice de polidispersão (PI) e o Potencial Zeta (ZP). A combinação dos quatro fatores resultou num total de 24 “tratamentos” (24 misturas). Adicionalmente, os pontos centrais dos três primeiros fatores foram também inseridos, os quais, combinados com os três níveis de velocidade de homogeneização, resultaram em três tratamentos adicionais que foram replicados três vezes cada. O planejamento fatorial desenhado originou assim a produção de um total de 33 emulsões do tipo A/O/A, por combinação dos quatro fatores, as quais foram caracterizadas fisico-quimicamente através da determinação, ao longo do tempo de armazenamento, do tamanho hidrodinâmico de partícula (HS), distribuição de tamanhos de partícula (PI) e carga superficial das partículas através da determinação do Potencial Zeta (ZP). As variáveis HS, PI e ZP foram medidas em triplicata, para cada mistura, e os valores médios foram considerados para as análises estatísticas dos resultados. Para a formulação ótima, foram ainda realizadas análises por FTIR, DRX, crio-MET, TGA e DSC. Foi ainda determinada a eficiência de encapsulação da emulsão otimizada estatisticamente, bem como analisada estatisticamente a sua estabilidade ao longo de um período de armazenamento de um ano. Resultados e Discussão: As concentrações de proteína e dos emulsificantes lipofílico e hidrofílico, e a velocidade de homogeneização, foram estabelecidas como as quatro variáveis independentes, enquanto que HS, ZP e PI foram estabelecidas como variáveis dependentes. O desenho fatorial 23x31 construído levou à otimização dos níveis alto (+1) e baixo (-1), com testes em triplicata para o nível central (0), produzindo assim trinta e três formulações e levando à seleção dos parâmetros processuais otimizados como sendo 0,015% (m/m) de entidade proteica (nível alto, +1), 0,75% (m/m) de emulsificante lipofílico (lecitina de soja) (nível alto, +1) e 0,50% (m/m) de emulsificante hidrofílico (poloxâmero 188) (nível baixo, -1). Assim, o planejamento fatorial estatístico levou à produção de uma emulsão ótima possuindo partículas essencialmente homogêneas com tamanho hidrodinâmico médio (n=3) de (186,2 ± 2,6) nm e potencial Zeta médio igual a (-36,5 ± 0,9) mV, e exibindo um índice de polidispersividade igual a 0,206 ± 0,014. Estes valores foram obtidos para um parâmetro processual de velocidade de homogeneização de 12500 rpm. Estas variáveis foram críticas para a produção de dispersões estáveis de nanogotas lipídicos com núcleo aquoso, permitindo a estabilização da emulsão por 180 dias em armazenamento a 4 °C. As variáveis de resposta HS, PI e ZP não exibiram qualquer correlação entre elas, como pode ser concluído a partir dos coeficientes de correlação e p-valores obtidos para PI vs. ZP (r = 0,205, p-valor = 0,338; p-valor > 0,05, pelo que não existe correlação significativa entre PI e ZP), PI vs. HS (r = 0,277, p-valor = 0,191; p-valor > 0,05, pelo que não existe correlação significativa entre PI e HS) e HS vs. ZP (r = -0,360, p-valor = 0,084; p-valor > 0,05, pelo que não existe correlação significativa entre HS e ZP). Desta forma, estas variáveis puderam ser analisadas individualmente, isto é, uma análise de variância (ANOVA) foi realizada para cada uma delas. Caso contrário, se tivessem sido encontradas quaisquer correlações estre estas variáveis de resposta, teria de ser realizada uma análise de variância multivariada (MANOVA). Conclusões: A partir das análises estatísticas realizadas, pode ser concluído que a formulação ótima para a encapsulação de entidades proteicas foi a emulsão ME25 (ou ME03/12500rpm).
PneumoPhageKill: estabilização estrutural e funcional de partículas bacteriofágicas em emulsões do tipo A/O/A : sistema bioterapêutico para tratamento de pneumonia bacteriana por nebulização
(2016) Rios, Alessandra Cândida
A terapia fágica, através da aplicação de partículas bacteriofágicas (PBs) estritamente líticas para a bactéria alvo hospedeira diretamente no local da infecção, tem sido proposta como uma potencial alternativa/complemento aos antibióticos convencionais. As principais vantagens das PBs no tratamento de infecções bacterianas residem na manutenção de uma elevada concentração de PBs no local da infecção enquanto existirem células bacteriana salvo viáveis, na sua elevada especificidade, e na produção de enzimas específicas (holinas e lisinas) que hidrolisam a matriz polimérica dos biofilmes bacterianos, favorecendo assim a sua penetração e ação antibacteriana. Uma alternativa para a veiculação das PBs de forma a manter sua estrutura e funcionalidade viáveis reside no encapsulamento no núcleo aquoso interno de nanovesículas lipídicas integrando sistemas de emulsão múltipla do tipo águaem-óleo-em-água (A/O/A), pois existe um delicado equilíbrio entre a estabilidade e a flexibilidade necessárias à função das biomoléculas associado à importância da superfície das moléculas de natureza proteica para a sua estabilidade, uma vez que é através desta interface que a entidade proteica interage com o microambiente que a rodeia. O objetivo principal deste trabalho consistiu na investigação do potencial de nanoencapsulamento e proteção de PBs estritamente líticas para Pseudomonas aeruginosa, com consequente estabilização estrutural e funcional de tais entidades. Foram produzidas emulsões múltiplas do tipo A/O/A pelo método de emulsificação em duas etapas, integrando PBs encapsuladas no núcleo aquoso interno das nanovesículas lipídicas constituintes da emulsão múltipla, e formuladas soluções isotônicas com vista à sua administração por nebulização. A propagação das PBs na suspensão estoque no seu hospedeiro bacteriano específico (P.aeruginosa) resultou numa suspensão concentrada de PBs com concentração média igual a (2.983±0.416)x109 viriões mL-1. Três emulsões múltiplas A/O/A foram produzidas, com 10 µL ou 1000 µL de suspensão concentrada de PBs na fase aquosa interna ou com 10 µL de uma mistura de LB-top ágar (4 mL) e tampão fágico (3 mL) na fase aquosa interna (emulsão múltipla placebo). Uma maior quantidade de PBs não provocou quaisquer alterações nos valores de Potencial Zeta (ZP) mas amplificou as propriedades antibacterianas da emulsão múltipla. A eficiência de encapsulação (EE) de PBs da emulsão ME1000 foi EE=89.2%. É digno de nota lembrar que esta eficiência de encapsulação está relacionada apenas com viriões de fagos, uma vez que as leituras de absorbância foram feitas por forma a excluir os detritos celulares e quaisquer outras proteínas intracitoplasmáticas liberadas pela lise celular bacteriana. O coeficiente de difusão das nanovesículas lipídicas integrantes da ME1000 foi calculado através da equação de Stokes-Einstein e produziu o valor de 2.607x10-12 m2.s-1, comparável e da mesma ordem de grandeza (10-12 m2.s-1) que os resultados publicados por vários outros pesquisadores. Devido às muito baixas quantidades de ME1000 adicionadas à solução salina, as misturas resultantes eram já naturalmente isotônicas e adequadas para administração via nebulização. Dado que o volume normalmente projetado durante um jato de nebulização é da ordem de grandeza de 500 µL, e porque (pelo menos em teoria) uma única PB seria suficiente para erradicar completamente uma infecção bacteriana, todas as soluções isotônicas testadas seriam altamente eficazes na erradicação de uma infecção bacteriana pulmonar por Pseudomonas aeruginosa. Com base nos resultados obtidos pelos testes de viabilidade celular (MTT e citometria de imagem), é possível argumentar que as soluções isotônicas testadas e preparadas com o sistema ME1000 exibiram uma boa viabilidade celular e baixa citotoxicidade, não possuindo características que promovessem lesões no DNA. Uma importante contribuição para a elevada estabilidade dos sistemas de emulsão múltipla produzidos com PBs (estritamente líticas) encapsuladas foi muito provavelmente os valores muito negativos de ZP obtidos para a ME1000, promovendo repulsão eletrônica das partículas e mantendo-as em suspensão, também corroborado pelo coeficiente de difusão calculado para as nanovesículas lipídicas integrantes da emulsão múltipla (2.607x10-12 m2.s-1), com ordem de grandeza relacionada com a estabilidade de uma emulsão múltipla. Porque o aprisionamento de entidades proteicas bioativas (tais como as PBs) promove uma alteração nas condições termodinâmicas do nanoambiente que rodeia cada partícula e, devido ao fato de que os movimentos das moléculas de solvente (aquoso) na sua microvizinhança ficam seriamente reduzidos pelo efeito de estarem contidos no seio do núcleo aquoso da matriz, o resultado final é uma estabilidade termodinâmica aumentada com potenciação da viscosidade rotacional, translacional e vibracional das PBs, promovendo uma arquitetura tri-dimensional mais rígida com consequente decréscimo da entropia e promovendo assim a estabilização estrutural e funcional das PBs. Para as linhagens celulares testadas, as soluções isotônicas integrando a ME1000 não exibiram efeitos genotóxicos significativos às três concentrações de ME1000 testadas (i.e., 0.3%, 0.6% e 0.9%, v/v), o que está em perfeita concordância com a ausência de efeitos citotóxicos observados para ambas as linhagens celulares. O uso da ME1000 na formulação de uma solução isotônica para nebulização no tratamento de infecções bacterianas pulmonares por P. aeruginosa possuiria vantagens inerentes, quando comparado com as formulações químicas antimicrobianas convencionais, uma vez que PBs específicas e estritamente líticas são predadores naturais e auto-replicantes das bactérias sendo virtualmente inofensivas tanto para células como tecidos humanos.
PneumoPhageSensing: desenvolvimento de um biossensor para pseudomonas aeruginosa com base em partículas bacteriofágicas estritamente líticas
(2021) Harada, Liliam Katsue
O uso indiscriminado dos antibióticos, aliado à enorme capacidade adaptativa das bactérias, possibilitou o surgimento de cepas bacterianas com variáveis e crescentes níveis de resistência aos mesmos. Tal resistência limita a eficácia do arsenal terapêutico disponível para o tratamento contra infecções por cepas multirresistentes. Esta realidade tem provocado dificuldades acrescidas no controle das infecções, contribuindo tanto para o aumento dos custos do sistema de saúde e das unidades de cuidados de saúde, como tem graves consequências para a saúde dos pacientes, prolongando o tempo de permanência nestas unidades e elevando os custos a ela associados. Além disto, contribuiu significativamente para a morbidade e mortalidade de pacientes hospitalizados. Sendo assim, as infecções hospitalares representam um grande desafio a ser enfrentado tanto pelo poder público como pela sociedade, na execução de ações de prevenção e controle de infecções nas unidades de cuidados de saúde. Dentre os microrganismos causadores de infecções hospitalares pode destacarse a Pseudomonas aeruginosa, bactéria oportunista que representa grande ameaça a pacientes nos serviços de saúde. O presente trabalho de pesquisa teve como objetivo desenvolver um sistema de biodetecção da bactéria Pseudomonas aeruginosa, com base no uso de um biohidrogel cromogênico sensível a alterações de cor, contendo um coquetel de partículas bacteriofágicas específicas e estritamente líticas, isoladas de fontes ambientais. As partículas fágicas isoladas foram extensamente caracterizadas tanto fisicoquímica como biologicamente. Os bacteriófagos isolados pertencem à ordem Caudovirales uma vez que têm cauda, com os fagos ph0031 e ph0034 a pertencerem, provavelmente, à família Myoviridae, e o fago ph0041 a pertencer, provavelmente, à família Siphoviridae, com tamanhos de genoma estimados em 62.5 kbp (fago ph0031), 106.9 kbp (fago ph0034) e 44.5 kbp (fago ph0041), com todos os fagos a serem capazes de se ligarem a várias estirpes de P. aeruginosa provenientes de isolados clínicos e levarem à sua morte. Os fagos ph0034 e ph0041 parecem ser bastante rápidos a lisarem o hospedeiro, com tamanhos de explosão de 20 UFP/célula hospedeira (fago ph0031), 28.3 UFP/célula hospedeira (fago ph0034) e 84.2 UFP/célula hospedeira (fago ph0041), indicando que se replicam eficientemente em P. aeruginosa com curtos períodos de latência (30 min, 10 min e 30 min para os fagos ph0031, ph0034 e ph0041, respetivamente). Os fagos isolados causaram uma elevada redução no crescimento de células de P. aeruginosa, mas os seus efeitos ocorrem apenas após as primeiras 8 h de incubação. Para o desenvolvimento de um sistema de biodetecção bacteriana, duas abordagens foram seguidas, integrando reagentes específicos numa matriz biopolimérica, em concentrações variáveis, com o objetivo de produzir sinal colorimétrico/bioluminescente em presença de um determinado componente citoplasmático liberado por lise fágica de células de Pseudomonas aeruginosa em contato com a matriz cromogênica. As partículas fágicas imobilizadas mostraram-se viáveis e mantiveram sua atividade lítica após o processo de polimerização que conduziu aos hidrogéis cromogênicos biorreativos, permitindo assim concluir que a estabilização tanto da sua estrutura como da sua função foi plenamente atingida. Usando o sistema de biodetecção I, para números de células bacterianas até 107 UFC nenhuma mudança visível na cor pode ser observada além de 180 min de ensaio, permitindo inferir que a presença desta bactéria num fluído poderia ser detectada dentro de um período de ensaio de 3 h usando este biossensor. Utilizando o sistema de biodetecção II, desenvolveu-se bioluminescência após contato da bactéria com o hidrogel. A partir dos sinais de bioluminescência capturados pelo sensor LDR, quatro momentos principais puderam ser definidos, estando estes em estreita concordância com a duração geral de um ciclo lítico, e permitiram detectar positivamente uma carga bacteriana de P. aeruginosa num período de tempo inferior a 180 min. Com relação ao sinal proveniente do sensor de estado sólido (fotodiodo), ele foi um tanto errático sem uma correspondência clara com o sinal do sensor LDR e, portanto, o sensor fotodiodo foi considerado não adequado para o propósito pretendido do sistema de biodetecção bacteriana II. Os resultados obtidos neste trabalho de pesquisa permitem concluir que ambos os dispositivos de biossensor foram capazes de detectar positivamente a presença de células de P. aeruginosa dentro de um período de ensaio de 3 h. Hidrogéis cromogênicos biorreativos facilitam o manuseio e, portanto, são desejáveis ao projetarse um sistema integrado de biodetecção bacteriana de utilização prática. Neste caso, os hidrogéis biorreativos aprisionando partículas bacteriofágicas e exibindo características cromogênicas / bioluminescentes foram utilizados com sucesso para detectar células de P. aeruginosa supostamente presentes em fluídos biológicos dentro de um intervalo de tempo de 180 min e, portanto, exibem potencial para uso em (mas não limitado a) ambientes hospitalares.
Remoção de estrogênios de águas tratadas destinadas ao consumo humano, por adsorção em carvão ativado de casca de coco: estudo de caso com 17-a-estradiol e 17-ß-estradiol
(2018) Bovo, Márcia Regina Teles
Hormônios e fármacos são excretados tanto por seres humanos como por animais, contaminando o solo e as águas. Os tratamentos convencionais de esgotos não removem essas substâncias, que acabam chegando às águas de abastecimento, sendo que muitas dessas substâncias continuam bioativas e podem gerar diversos problemas de saúde. O presente trabalho de pesquisa tem como objetivo propor uma opção para a remoção por adsorção dos hormônios 17-α-estradiol e 17-β-estradiol de águas destinadas ao consumo humano, através do uso de carvão ativado de casca de coco, bem como identificar e quantificar essas substâncias. A represa do Ferraz e a Estação de Tratamento de Água do SAAE localizadas no bairro Éden, em Sorocaba/SP, responsáveis pelo abastecimento do bairro Éden e bairros adjacentes, foram escolhidas para realização desse estudo. As 72 amostras de água coletadas, tanto entre água bruta proveniente da represa como durante as etapas de tratamento e reserva, não acusaram a presença dos dois hormônios em estudo quando analisadas por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE), apresentando-se assim de boa qualidade em relação aos hormônios estudados. O sistema de adsorção com carvão ativado de casca de coco implementado primeiramente em escala laboratorial e, posteriormente escalonado para nível industrial, visando a aplicação na estação de tratamento de águas em questão, mostrou ser uma opção com potencial de integração no sistema de tratamento convencional de água.

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